Zusammenfassung

Die Protonen-Minibeamtherapie ist eine räumliche Fraktionierungsmethode der Strahlentherapie von Tumoren um das therapeutische Fenster zu erweitern. Die submillimeter großen Protonenbeams (Minibeams) werden als planare oder Pencil Beams mit einem Abstand (Mitte zu Mitte; engl.: center-to-center ctc) von wenigen mm auf den Patienten appliziert. Aufgrund der Kleinwinkelstreuung der Protonen weiten diese Kanäle mit zunehmender Tiefe auf und erlauben, durch die Anpassung der ctc-Abstände an die Tumortiefe und Tumorgröße, eine überlappende und bis zu homogene Dosisverteilung im Tumorvolumen. Somit kann der Tumor wie bei der konventionellen Strahlentherapie homogen bestrahlt werden, gleichzeitig sorgt das Minibeammuster, aufgrund der Niedrigdosisbereiche zwischen den Minibeams, für eine Schonung des gesunden Gewebes und führt zur Reduzierung der Nebenwirkungen.
Ziel dieser Arbeit war es, sowohl das Verständnis der räumlichen Fraktionierung im Hinblick auf die Gewebeschonung durch Experimente am Rasterionenmikroskop SNAKE zu verbessern, als auch die Protonen-Minibeamtherapie mit Hilfe von theoretischen Dosis- und Zellüberlebensberechnungen weiterzuentwickeln.
Im ersten Experiment wurde die Abhängigkeit von unterschiedlichen Protonen-Minibeam-Dosismodulationen und ihrer biologischen Strahlenantwort in einem in-vivo-Mausohrmodell gesunder BALB/c-Mäuse untersucht. Die Strahlgrößen der Pencil Minibeams von σ = 95 µm bis σ = 883 µm (Standardabweichung) wurden auf einem 4×4-Gitter mit 1,8 mm Gitterabstand (ctc) und einer mittleren Dosis von 60 Gy appliziert. Die Minibeammuster entsprachen dabei σ/ctc-Verhältnissen zwischen 0,05 und 0,5, wobei ein σ/ctc von 0,5 (oder größer) einer homogenen Bestrahlung gleichzusetzen ist. Die Ergebnisse dieser Mausstudie geben einen Einblick in die schonende Wirkung unterschiedlicher Dosisverteilungen von Minibeam-Bestrahlungen, so wie sie entweder auf der Haut appliziert werden können oder aufgrund der Aufstreuung der Minibeams mit zunehmender Tiefe auftreten. Sichtbare Hautreaktionen und Ohrschwellungen wurden für 90 Tage nach Bestrahlung beobachtet und gemessen. Dabei zeigte sich, dass die auftretenden Gewebetoxizitäten mit schwächer werdender Dosismodulation bzw. Annäherung an eine homogene Bestrahlung (σ/ctc = 0,5) zunahmen. Das Gewebeschonungspotenzial der Protonen-Minibeam-Bestrahlung nimmt also mit der Tiefe ab, ist aber der konventionellen Bestrahlung mit Protonen über den gesamten Eintrittskanal überlegen. Das σ/ctc-Verhältnis ohne jegliche Nebenwirkungen im Mausohrmodell konnte zu σ/ctc = 0,032 extrapoliert werden.
Im zweiten Tierversuch wurde ebenfalls das Ohrmodell der BALB/c-Maus verwendet um die Kombination aus zeitlicher und räumlicher Fraktionierung zu untersuchen. Vier Fraktionen wurden im Abstand von 24h mit 16 Protonen-Minibeams (σ = 222 µm; ctc = 1,8 mm) und einer mittleren Dosis von 30 Gy pro Fraktion bestrahlt. Die Minibeams wurden exakt (FS1) oder mit einer maximalen räumlichen Verschiebung zwischen den zeitlichen Fraktionen (FS2) wiederbestrahlt. In der dritten Bestrahlungsgruppe (FS3) wurden die resultierenden 64 Protonen-Minibeam-Positionen aus FS2 (σ = 222 µm; ctc = 0,9 mm) ebenfalls mit 30 Gy mittlerer Dosis pro Fraktion exakt wiederbestrahlt. Der halbe Gitterabstand (ctc) in FS3 veränderte die tägliche Dosisverteilung zu erhöhten Dosen zwischen den Minibeams im Vergleich zu FS1 und FS2, wobei die integrale Dosisverteilung nach der vollständigen Behandlung identisch mit der integralen Dosisverteilung von FS2 war. Dadurch konnte der Einfluss der Dosisverteilung pro Fraktion bewertet werden. Die Wiederbestrahlungsgenauigkeit betrug (110±52) µm mit welcher die Bestrahlung der stark modulierten Dosisverteilungen von FS1 zu einer maximalen Ohrschwellung von nur 1,6-mal der Kontrollgruppe resultierte. Die Bestrahlung mit maximal verschobenen Minibeams (FS2) führte zu einer 2,4-fachen Ohrschwellung im Vergleich zur Kontrollgruppe (sham). Die genaue Bestrahlung mit den schwächeren Dosismodulationen von FS3 ergab sogar eine dreifache Ohrdicke im Vergleich zur sham-Gruppe. Eine erhöhte Ohrdicke wurde sowohl für die FS2 ( 1,4-fach) also auch für die FS3 ( 1,7-fach) Gruppe am Ende der Beobachtungszeit von 160 Tagen gefunden. In FS2 und FS3 wurden durch histologische Schnitte eine signifikant erhöhte Menge an fibrotischem Gewebe nachgewiesen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die größte Gewebeschonung bei der zeitlich fraktionierten Protonen-Minibeam-Bestrahlung bei genauer Wiederbestrahlung mit starken Dosismodulationen erreicht wird (FS1). Das maximale Verschieben pro Fraktion der gleichen, starken Dosismodulationen wie in FS1 (FS2) ist weiterhin von Vorteil, verglichen mit der genauen Wiederbestrahlung einer schwächeren Dosismodulationen (FS3). Zudem ist zu erwarten, dass die zeitlich fraktionierte Protonen-Minibeam-Therapie einen Vorteil gegenüber der fraktionierten konventionellen Strahlentherapie hat.
Im letzten Teil dieser Arbeit wurden Weiterentwicklungen und mögliche Anwendungsvarianten von Protonen-Minibeams anhand von theoretischen Dosisberechnungen betrachtet und bewertet. Dazu wurde ein 5 cm dicker Tumor als Modell angenommen, der sich in 10 cm Tiefe befand. Es wurde eine Bestrahlungsplanung für aus zwei gegenüberliegenden oder vier orthogonalen Richtungen mit ineinander verschachtelten (engl.: interlaced) Minibeams berechnet. Zusätzlich wurde die Kombination von verschachtelten Minibeams und heterogener Tumordosis untersucht. Die Dosisberechnungen wurden in ein klonogenes Zellüberleben übersetzt, um ein optimiertes Zell-überleben in unmittelbarer Tumornähe zu evaluieren. Die Verschachtelung von Protonen-Minibeams in Kombination mit homogener Tumorbestrahlung erzielte nur geringe Vorteile für das mittlere klonogene Zellüberleben im Vergleich zur ,,herkömmlichen" Minibeam-Bestrahlung aus nur einer Richtung (unidirektional). Wurden hete-rogene Dosisverteilungen unter der Voraussetzung einer Mindestdosis innerhalb des Tumors erlaubt, konnten größere ctc-Abstände zwischen den Minibeams gewählt werden. Dies führte zu einem verbesserten Zellüberleben trotz einer erhöhten mittleren Tumordosis, welche notwendig ist, um den Tumor mit der vorgeschriebenen Mindestdosis abzudecken. Verschachtelte Minibeams mit einer minimalen Tumordosis von mindestens 10 Gy konnten auch in der Nähe des Tumorrandes noch ein mittleres Zellüberleben von bis zu 47% erreichen. Den Berechnungen zufolge ist die Schonung durch Protonen-Minibeams vor allem bei hohen Dosisfraktionen von Vorteil und erlaubt möglicherweise eine hypofraktionierte Strahlentherapie oder sogar eine kurative Einzelfraktion. Ähnliche Vorteile wie für Minibeams mit Protonen werden ebenfalls für Schwerionen erwartet, welche den zusätzlichen Vorteil einer geringeren Aufstreuung haben und damit geringerer Schaden der einzelnen Minibeams zu erwarten ist.
Die im Rahmen dieser Dissertation erarbeiteten Ergebnisse zeigen im Detail das Schonungspotential der Protonen-Minibeam-Therapie. Eine differenzierte Auflösung der Protonen-Minibeam-Dosisverteilungen und deren Wirkung auf biologisches Gewebe ebnet den Weg für ein tieferes Verständnis der Schonungseffekte durch räumliche Fraktionierung. Eine erstmalige zeitliche Fraktionierung von Protonen-Minibeams deutet darauf hin, dass die schonende Wirkung der Minibeambestrahlung auch bei Fraktionierung im Vergleich zur konventionellen Strahlentherapie erhalten bleibt. Wesentliche Verbesserungen gegenüber der konventionellen Strahlentherapie konnten durch Dosis-Simulationen aufgezeigt werden. Dennoch müssen die experimentellen Ergebnisse in weiteren sowie menschlichen Gewebearten validiert werden. Die theoretischen Zell-überlebensberechnungen müssen in den Kontext eines komplexen biologischen Systems gestellt werden. Darüber hinaus muss die technische Machbarkeit eines klinisch einsetzbaren Protonen- oder Schwerionen-Minibeams geklärt werden, insbesondere für mögliche verschachtelte Minibeam-Bestrahlungsansätze.

Zusammenfassung

Ionisierende Strahlung und durch diese induzierte DNA Doppelstrangbrüche (DSB) gehören zu den alltäglichen Belastungen eines Organismus. Jede Zelle besitzt verschiedene Reparaturmechanismen, um dieser gesundheitlichen Bedrohung zu begegnen. Jedoch birgt ionisierende Strahlung auch potentiell wichtige medizinische Anwendungen wie beispielsweise Strahlentherapie zur Behandlung von Tumorerkrankungen. Die Erforschung der zu Grunde liegenden DNA-Reparaturprozesse ermöglicht es hierbei nicht nur in Zukunft einen besseren Schutz vor ionisierender Strahlung zu ermöglichen, sondern die gezielte Anwendung von Strahlung im medizinischen Rahmen noch effizienter zu gestalten. Hierfür ist nicht nur die Identifikation einzelner DNA-Reparaturproteine und die Quantifizierung des induzierten Schadens wichtig, sondern auch die Lokalisation des Schadens im Kontext des Chromatins hilft dabei, die Reparaturprozesse besser zu verstehen und medizinische Ansätze zu optimieren. Diese Arbeit beschäftigt sich mit drei Hauptaspekten zur Charakterisierung von DSB-Reparaturmechanismen. Es konnte eine neue Methode zur quantitativen Messung von hoch-LET (Linearer Energietransfer) induzierten Strahlenschäden entwickelt und der dazugehörige Grundsatzbeweis erbracht werden. Durch In-Situ Ligationsverfahren in Kombination mit In-Situ DNA-Blunting, war es möglich, so genannte DNA Oligo Sonden, bestehend aus kurzen einzelsträngigen DNA-Sequenzen, welche sich in Lösung zu Haarnadelstrukturen ausbilden, mit Fluorophoren zu koppeln und spezifisch an Doppelstrangbrüche zu binden. Die reduzierte Größe und das reduzierte Bindestellenvorkommen ermöglicht hierbei eine genaue und verlässliche DSB Detektion mittels STED-Mikroskopie (eng. Stimulated Emission Depletion). Des Weiteren war es durch Bestrahlungsexperimente mit fokussierten Kohlenstoffionen möglich, nicht nur die grundlegendsten Reaktionen des Chromatins auf Bestrahlung mit hoch-LET Strahlung auszulösen und durch Lebendzellmikroskopie zu dokumentieren, sondern diese Chromatinremodellierungsprozesse auch zeitlich ab wenigen Sekunden bis mehreren Minuten nach Bestrahlung zu beobachten und mit Charakteristika mehrerer Reparaturproteine zu vergleichen. Ebenso war es möglich, durch die höchstauflösende Analyse von Überschneidungsbereichen der DNA-Reparaturproteine BRCA1, Rad51, 53BP1, γH2AX und Bestandteile des Chromatins, ein detailliertes Modell zur DNA-Reparatur im Kontext der Chromatinorganisation und im Einklang neuster Chromatinorganisationsmodelle, aufzustellen. Zusätzlich konnte im Laufe dieser Arbeit erstmals mittels ∝ - Bestrahlung von Zellkernen eine Migration von schwer reparierbaren DSB-Reparaturstellen vom Zellkerninneren zur Zellkernhülle und dort vermutlich zu spezialisierten Reparaturzentren dokumentiert und mittels STED-Mikroskopie zeitlich in existierende DSB-Reparaturprozesse eingeordnet werden.

When cells are irradiated with ionising radiation, the cells are damaged. This process is purposefully used in radiation therapy to treat tumour cells. However, this cell damage causes a problem for astronauts flying to Mars, since these are exposed to cosmic radiation for a long period of time. Therefore, it is important to gain a better understanding of the reactions of the cells to irradiation in order to be in a position to improve radiation protection and radiotherapy.
In this thesis, a deep learning algorithm was trained to characterize radiation damage in living cells on single cell level. For this purpose, a training dataset was created which consisted of phase contrast images of treated and untreated cells. This dataset was then used to train a Convolutional Neural Network. At the end the results of the training were evaluated. It turned out that the algorithm reached evaluation scores of at least 94 % in all learned classes. It could thus be characterized as very reliable.
In addition, the mean duration of the cell cycle of untreated cells was determined to generate a database. This database is intended to serve the definition of radiobiological parameters, since it can be used to obtain information about the changed duration of cell cycles or the presence of cell arrest. The mean cell cycle duration was 19 hours.

[1] Nagamine, Yoshihiko ; Fujitaka, Shinichiro ; Honda, Takurou ; Akiyama, Hiroshi: Patient positioning device and patient positioning method. Mai 1 2007. – US Patent 7,212,608
[2] Girst, Stefanie ; Greubel, Christoph ; Reindl, Judith ; Siebenwirth, Christian ; Zlobinskaya, Olga ; Walsh, Dietrich W. ; Ilicic, Katarina ; Aichler, Michaela ; Walch, Axel ; Wilkens, Jan J. u. a.: Proton minibeam radiation therapy reduces side effects in an in vivo mouse ear model. In: International Journal of Radiation Oncology* Biology* Physics 95 (2016), Nr. 1, S. 234–241

Therefore, in this thesis a method was developed, with which the mitochondrial networks of living cells were imaged with confocal microscopy also over time and were analyzed with regard to various morphological parameters like the mitochondrial network size, to investigate the cells stress level before and after irradiation. So I concluded that the morphological parameters of a single unirradiated cell oscillates over time up to 40 % around a constant value. Also between different cells the results vary and result in high standard deviations from 12.5 % up to 68 %. A repetition of this experiment showed reproducible results and so this method is suitable for analyzing high morphological differences in the mitochondrial networks. Now it can be investigated which changes occur in the mitochondrial networks after irradiation.

Thus an approach will be described in the second part of this thesis, with which a targeted irradiation of mitochondria followed by longterm imaging is possible. For the targeted irradiation the ionmicrobeam SNAKE at the tandem accelerator of the Maier-Leibnitz-Laboratory in Garching was used, which is able to focus 55 MeV carbon ions to a beam spot size of about 1 micro m. This is suitable to irradiate subcompartments of cells. But such an irradiation takes a high effort, so in this thesis a method for seeding only small cell numbers (approx. 100) on four small areas (diameter: 0.4 mm) was etablished. In a first testexperiment every single cell was irradiated in the mitochondrial area with 5120 carbon ions distributed in one of three different areas (13.2 micro m², 7.0 micro m² und 2.7 micro m²). After that the cells were observed with phase contrast microscopy for 3.5 days. During the observation the cell number of the irradiated cells stays constant, while the unirradiated control group shows an exponential growth. Then the accuracy of the microbeam targeting was checked with a nuclear track detector, which shows, that 3 % of the ions were scattered up to 570 micro m away from target. This results in a dose of (1 ± 1) micro m over the cell area, that originated only from scattered ions. So the probability of hitting a cell nucleus became very likely. Therefore the microbeam was optimized in further experiments by using instead of 5-times positively charged carbon ions 6-times positively charged carbon ions. Additionally the slit positions were adjusted and lens errors due to focusing of the beam were corrected. With this changes the number of non-focused ions was reduced to 1 % and the maximal scattered distance to 180 micro m away from target.

The in-pile positron source NEPOMUC provides a once-re-moderated positron beam of 3.0⋅10⁷ e⁺/s , 20 eV kinetic energy, about 2 mm diameter and a transverse phase space volume in the range of 4.2 mm²eV·m_e. To generate a beam spot of ≤ 2 μm on the sample, the SPM requires a phase space of less than 0.7 mm²eV·m_e. For this reason, the interface is equipped with an additional re-moderation stage, which enhances the beam brightness. With every additional component, however, the manual beam alignment becomes more delicate and time consuming. Therefore, devices for beam characterization and automated beam alignment have been developed and applied with great success. Furthermore, a serious problem is that every re-moderation step leads to a loss of several keV total beam energy. Limitations, which issue from the low beam energy and the restricted space between microscope and interface, prevent an increase of the kinetic beam energy by a conventional radio frequency accelerator. Thus, we developed a new device, which increases the potential beam energy without altering any other beam parameters. To stress the differences we call the setup elevator. This final device is indispensable to operate the SPM at NEPOMUC. To verify that the high beam quality, which is achieved by the SPM interface, gets not lost as a result of the energy elevation, we determined the transverse phase space as 0.012 mm²eV·m_e for an 1-keV-elevated beam. The results show that the elevator concept and design work. In addition, the elevator is also of advantage for other positron beam facilities, since it offers the possibility to bias source and sample on the same potential.

Damit konnten strukturelle und funktionale Domänen der Anlagerung von Proteinen, welche für das Auffinden und die Reparatur von Doppelstrangbrüchen verantwortlich sind, detailliert untersucht werden.Weitergehend konnten diese Domänen mit der Chromatinstruktur höherer Ordnung, also der Lage der DNA innerhalb des Zellkerns, verknüpft werden. Hierzu wurde die Korrelation der wichtigen Reparaturproteine 53BP1,γH2AX, Rad51 sowie Brca1 nach hoch- und niedrig-LET Bestrahlungen untersucht. Hierbei zeigen γH2AX und 53BP1, obwohl sie der gleichen Reparaturdomäne, dem sogenannten ''flanking chromatin'' zugeordnet werden nur teilweise Korrelation, welche unabhängig vom linearen Energietransfer der Teilchen ist. 53BP1 und Rad51 schließen sich ebenso LET unabhängig gegenseitig aus, was deren unterschiedliche Rolle während der Reparatur und die Zugehörigkeit zu verschiedenen Domänen widerspiegelt. Als Mediator zwischen den beiden Proteinen und somit Domänen wurde Brca1 identifiziert, welches ähnliche Zeitverläufe, wie Rad51 zeigt, jedoch nur teilweise räumlich mit Rad51 korreliert. Weitergehend wurden bei den Proteinen 53BP1 und γ-H2AX, welche sich nach Kohlenstoffbestrahlung in (540 ± 60) nm großen IRIF (engl.: ionizing radiation induced foci) und nach Protonenbestrahlung in (410 ± 30) nm großen IRIF anlagern, Nanostrukturen innerhalb der IRIF identifiziert. Diese Strukturen haben unabhängig vom LET eine Größe von 120 nm - 140 nm und entsprechen der ebenso LET unabhängigen IRIF Größe von Rad51 von (142 ± 13) nm, welche selbst keine Nanostruktur zeigen. Diese Strukturen in Kombination mit den Korrelationsmessungen lassen sich mit der Chromatinstruktur höherer Ordnung verbinden. So konnte Rad51 als direkte Markierung des Schadensorts identifiziert werden, welche in einer Region von dekondensierter DNA liegt, dem sogenannten Perichromatin. Dies hat eine Breite von 100 nm - 200 nm und wird um den Schaden in einem größeren Bereich durch das Protein 53BP1 stabilisiert. Das phosphorylierte Histon H2AX (γ-H2AX) markiert hingegen direkt die Chromatin Territorien und somit die DNA. Als zweites wesentliches Ergebnis wurde die initiale Anzahl an IRIF des Schadensmarkers DNA-PKcs wenige Minuten nach Bestrahlung mit Hilfe höchstauflösender STED Mikroskopie bestimmt. Die IRIF haben eine mittlere Größe von  190 nm, was die Trennung von DSB ermöglicht, welche nur durch solch kleine Abstände getrennt sind. Für 27 MeV Kohlenstoffbestrahlung (LET = 500 keV/μm) am Rasterionenmikroskop SNAKE in Garching wurden (4,5 ± 0,9) IRIF/μm und für 20 MeV Lithiumbestrahlung (LET = 116 keV/μm) wurden (2,8 ± 0,5) IRIF/μm . Beides verbessert nicht nur bisherige Messungen um einen Faktor  3 sondern übersteigt auch die Anzahl von durch Monte- Carlo basierten Simulationen mit PARTRAC vorhergesagten Schadenszahlen um einen Faktor 2 - 2,5. Diese Messungen stellen damit eine gegenüber bisherigen Messungen essentiell verbesserte Datenbasis dar, um die erhöhte relative biologische Wirksamkeit von hoch-LET Strahlung besser modellieren und damit verstehen zu können.

Das präsentierte neue Zielbestrahlungskonzept ermöglicht es, Substrukturen in Zellen mit einer Genauigkeit von besser als (0,4 ± 0,7) μm in X-Richtung und (-0,2 ± 0,8) μm in Y-Richtung mit einzelnen, abgezählten Ionen zu bestrahlen. So wird ein Nucleolus mit 3 μm Durchmesser von einem einzeln applizierten Ion zu mehr als 80% Wahrscheinlichkeit getroffen. Die Bestrahlung von 15-20 Zellen eines Kamerablickfeldes dauert dabei etwa 1 min, wodurch auf einer Probe mehr als 1000 Zellen pro Stunde gezielt bestrahlt werden können.

Diese methodische Entwicklung macht die Behandlung neuer Fragestellungen in der Strahlenbiologie möglich und wird schon erfolgreich für Projekte, wie der Untersuchung der Strahlensensitivität von Mitochondrien oder dem Vergleich von UV-Mikrobestrahlungen mit Ionenbestrahlungen angewendet. Als treibende Idee dieser Entwicklung wurde in dieser Arbeit erstmals mit einer gezielten Nucleolusbestrahlung mit 55 MeV Kohlenstoffionen die Hypothese getestet, ob der Zellkern homogen auf Strahlung sensitiv ist. Dazu wurde gezielt der Nucleolus oder der Zellkern mit ausgesparten Nucleoli mit 3 Ionen auf einen Punkt bestrahlt, was auf den Zellkern gemittelt etwa 1,1 Gy entspricht, und ein Zytokineseblock-Mikrokerntest durchgeführt. Es ergaben sich mit (0,34 ± 0,04) nach Nucleolusbestrahlung (NB) und (0,35 ± 0,04) nach „Zellkern ohne Nucleolus“-Bestrahlung (ZB) die gleichen Mikrokernraten pro doppelkerniger Zelle, die aber deutlich erhöht zu den Kontrollpositionen mit (0,073 ± 0,019) und (0,073 ± 0,022) sind. Nach NB wurde eine signifikant höhere Doppelkernrate von (0,60 ± 0,04) pro bestrahlter Zelle beobachtet als nach ZB mit (0,508 ± 0,023). Bei unbestrahlten Zellen lag die Doppelkernrate bei (0,600 ± 0,024). Offensichtlich wird der Zellzyklus nach NB etwas weniger verzögert als nach ZB. Bei beiden Endpunkten ist der Unterschied jedoch deutlich geringer als man anhand des DNADichteunterschieds annehmen würde (DNA-Dichte im Nucleolus ≈ 5% DNA-Dichte im Zellkern). Damit wirken sich im Nucleolus erzeugte DNA-Schäden scheinbar schwerer aus als im restlichen Zellkern.

Zusätzlich wurde überprüft, ob eine gezielte Bestrahlung des Nucleolus mit 1, 10, 50 und 100 Kohlenstoffionen eine Stressantwort der Nucleoli in der Zelle hervorruft. Eine auftretende nucleoläre Segregation mittels Färbung des UBF-Proteins, wie nach UV-Bestrahlung beobachtet wird, wurde weder in allen Nucleoli eines Zellkerns noch an dem bestrahlten Nucleolus in Folge der Ionenbestrahlung beobachtet. Jedoch ergab die Analyse der Transkription, dass an der Stelle eines Nucleolustreffer zu mehr als (90 ± 20)% das Signal des 5EU-Einbaus in die rRNA des Nucleolus verringert ist. Während-auch keine generelle Umverteilung des Parp1-Proteins über den kompletten bestrahlten Nucleolus beobachtet wurde, kam es jedoch zu (57 ± 15)% lokal an der Stelle-des reduzierten 5EU-Signals zu einer lokalen Verringerung des Parp1-Signals. Dies lässt auf eine von der Ionenzahl unabhängige lokale Hemmung der rRNA-Transkription -im Nucleolus schließen.

Abstract:

In this thesis, a setup for targeted irradiation of cellular and nuclear substructures at the ion microbeam SNAKE was developed, successfully installed and characterized. This development builds the methodical basis for investigations into the sensitivity of the nucleolus, which is in the nucleus, to ionizing radiation.

The presented new targeted irradiation concept enables the irradiation of substructures in the nucleus with an accuracy of less than (0.4 ± 0.7) μm in X-direction and (-0.2 ± 0.8) μm in Y-direction with single counted ions. Thus a nucleolus of 3 μm diameter is hit by a single applied ion with a probability of more than 80%. Irradiation of 15-20 cells in one field of view of the microscope camera takes about 1 min, whereby in one sample more than 1000 cells per hour can be irradiated.

This methodical development enables the investigation of new questions in radiobiologyand is successfully used in projects like the investigation of the radiation sensitivity of mitochondria or the comparison of UV microirradiations with ion irradiations. For the first time, as the main motivation for this development, in this
thesis the hypothesis was tested by a targeted irradiation of the nucleolus with 55 MeV carbon ion, if the nucleus is homogenously sensitive towards radiation. For
this purpose, the nucleolus or the nucleus without the nucleoli were irradiated with 3 ions in one spot, which equates to an average dose of 1.1 Gy to the nucleus. Following the irradiation a cytokinesis-block micronucleus assay done. The micronuclei yield per binucleated cell were similar with (0.34 ± 0.04) after nucleolus irradiation (NB) and (0.35 ± 0.4) after ''nucleus without nucleolus'' irradiation (ZB), but clearly higher than at the control positions with (0.073 ± 0.019) and (0.073 ± 0.022). After NB a significantly higher yield in binucleated cells of (0.60 ± 0.04) was investigated than after ZB with (0.508 ± 0.023). In unirradiated cells the yield of binucleated cells was (0.600 ± 0.024). Obviously, after NB the cell cycle is less delayed than after ZB. However, in both endpoints the difference is clearly smaller than expected using the DNA density difference (DNA density in the nucleolus ≈ 5% DNA density in the nucleus). So DNA damages caused in the nucleolus seem to have more impact than in the residual nucleus.

Additionally, it was tested, if targeted irradiation of the nucleolus with 1, 10, 50 and100 carbon ions induces a stress response in the nucleoli. An occurring nucleolar segregationusing a staining of the protein UBF, as observed after UV irradiation, couldnot be observed in all nucleoli of the nucleus nor in the irradiated nucleolus using ions. However, analysis of the transcription showed, that at the spot of a nucleolus hit with more than (90 ± 20)% probability the signal of the incorporation of 5EU in the rRNA of the nucleolus is decreased. While no general reorganization of Parp1 in the complete irradiated nucleolus was observed, (57 ± 15)% of the spots with reduced 5EU signal showed a local reduction of the Parp1 signal. Thus, independent of the ion number the rRNA transcription in the nucleolus was locally inhibited.

The aim of this work was to elucidate the prospects of minibeam radiation therapy compared to conventional homogeneous broad beam radiotherapy in theory and in experimental studies at the ion microprobe SNAKE. Treatment plans for model tumors of different sizes and depths were created using the planning software LAP-CERR, to elaborate suitable minibeam sizes and distances for the individual tumors. Radiotherapy-relevant inter-beam distances required to obtain a homogeneous dose in the target volume were found to be in the millimeter range.

First experiments using proton minibeams of only 10 μm and 50 μm size (termed microchannels in the corresponding publication Zlobinskaya et al. 2013) and therapy-conform larger dimensions of 100 μm and 180 μm were performed in the artificial human in-vitro skin model EpiDermFT^TM (MatTek). The corresponding inter-beam distances were 500 μm, 1 mm and 1.8 mm, respectively, leading to irradiation of only a few percent of the cells in the skin tissue, but with significantly increased doses (up to 5000 Gy) compared to the average dose of 2 Gy, which was applied homogeneously in further skin samples for comparison. Gaussian-shaped minibeams of even larger sizes (σ = 260 μm and 520 μm, inter-beam distance 1.8 mm) were analyzed in further experiments to evaluate the effect of increasing beam sizes as in deeper-lying tissues. Acute side effects were quantified via the MTT tissue viability test and the release of inflammatory proteins into the culture medium and showed improved results for minibeam compared to homogeneous irradiation. Genetic damage, an indicator for secondary tumor induction, was analyzed via the micronucleus test in the epidermal keratinocytes and was less than half for minibeams up to 180 μm size compared to homogeneous fields. Increasing minibeam sizes, i.e. increasing fractions of irradiated skin receiving a dose higher than the average dose of 2 Gy) increased the number of micronuclei per divided cell, but never exceeded the genetic damage induced by a homogeneous dose distribution.

A more authentic and representative in-vivo skin model, accounting for higher complexity with blood vessels, further cell types, follicles glands and especially a working immune system, was used in the next step to further examine the side effects of minibeam radiotherapy compared to homogeneous irradiation. The central part of the ear of adult BALB/c mice was irradiated with 20 MeV protons, using an average dose of 60 Gy in a field of 7.2×7.2 mm². The 4×4 minibeams of nominal 6000 Gy had a size of 180×180 μm² and inter-beam distances of 1.8 mm, as in previous in-vitro skin experiments. Minibeam irradiation induced no ear swelling or other visible skin reaction at any time, while significant ear swelling (up to 4-fold), skin reddening (erythema) and desquamation developed in homogeneously irradiated ears 3-4 weeks after irradiation. Loss of hair and sebaceous glands only occurred in the homogeneous irradiation fields and did not recover during the monitoring phase of 90 days.

Taken together all theoretical considerations and experimental findings, proton minibeam radiation therapy appears suitable for the implementation in clinical tumor therapy using protons and/or heavy ions, as it reduces side effects in the normal tissue compared to conventional broad beam irradiation. However, the upper limit of the minibeam size for tissue sparing and the technical feasibility are still to be elucidated as current technologies might have to be improved and adapted for the generation of sub-millimeter proton beams of energies up to 250 MeV at therapy plants.

The aim of this work was to count every DSB that is induced by high-LET ionizing radiation in human HeLa cells. For this, the IRIF-formation of DNA-PKcs and KU70/80 was tested and examined. Induction of DSB was achieved by irradiation with α-particles and small angle irradiation at the ion microprobe SNAKE with lithium and carbon ions. Visualization of the target proteins’ distribution in the cell was accom- plished through the method of indirect secondary immunofluorescence staining and imaging was performed with the help of a super-resolution STED-microscope.

In the experiments, no IRIF-formation was detected for primary antibodies specifically targeting KU80 and DNA-PKcs after α-irradiation. The abundant presence of 400000 proteins of each type masked the signal of single proteins bound to double-stranded DNA, indicating that the proteins are not suitable for the counting of single DSB in their indistinguishable collective natural state. DNA-PKcs bound to DSB reportedly undergo phosphorylation at Thr2609, which leads to the dissociation from the DSB. Although this way the expected strong localisation at sites of DSB is lost, it allows for the discrimination of DNA-PKcs proteins that are not involved in damage response. Based on these findings in the relevant literature, the experiments were carried out and IRIF-formation for a primary antibody specific to phosphorylated DNA-PKcs was tested positive after α-particle irradiation. Furthermore, particle tracks were visible after lithium and carbon ion irradiation for samples fixed 2, 3 and 5 minutes post- irradiation. Evaluation of 30 particle tracks for each time point yielded an average number of 2.5±0.4 IRIF per micron after 2 minutes, which increased to 3.2±0.6 IRIF per micron 5 minutes after irradiation for lithium ions with LET=116±10 keV/μm. For carbon ions with LET=500±80 keV/μm , the number of observed IRIF increased from 4.1±0.6 per micron to 4.5±0.7 per micron from 2 to 5 minutes after irradiation. The increase for both ion types can be attributed to a delayed accumulation of protein to a fraction of DSB, which become accessible by changes in the conformation of hete- rochromatin at later times. PARTRAC simulations predict 2.7±0.4 DSB per micron for lithium and 10.2±2.2 DSB per micron for carbon ions. The number of observed IRIF for lithium ions exceeded the number from linear scaling of low-LET X-rays and matched well with the predicted number from PARTRAC. However, the observed number of IRIF for carbon ions was only half the number of the predicted DSB by PARTRAC. Thus, it is concluded that the goal of counting single DSB for high-LET irradiation can only be partly fulfilled: up to LET=116±10 keV/μm , the average spacing between DSB can be resolved by the IRIF-size with diameters from 188±36 nm to 205±49 nm. However, at LET=500±80 keV/μm , the decreased average spacing between consecutive DSB can no longer be resolved and is exceeded by the minimal observed IRIF-diameter of 178±40 nm. PARTRAC takes into account that DSB in close vicinity may not be resolvable and provides a reduced number of observable IRIF, which is derived by assigning all DSB within 150 nm to one observable cluster. This results in a predicted number of 3.3±0.3 observable IRIF per micron for carbon ions, which is matched and partly exceeded by the actual observed number of IRIF per micron. This indicates that the experimental results of this thesis are compatible with PARTRAC simulations.

DNA Double-Strand Breaks (DSB) are critical damages for a living cell. A variety of extra- and intracellular factors are able to induce DSB. Therefore, nature developed several specific and complex DSB-Repair mechanisms. One of them is homologous recombination (HR). It depends on a complex interaction between different proteins, accumulating in so called foci. These proteins use the homologous sister chromatid as a template to rejoin the loose DNA ends. The proteins BRCA1 and Rad51 have a key function in HR, but their specific responsibilities are not completely understood yet. The small size of the foci (few 100 nm) rules out a resolution via light microscopy because of the diffraction barrier of 250 nm. During this thesis, immunohistochemistry and STED microscopy (STimulated Emission Depletion) was used to image foci of BRCA1 and Rad51 during the repair of α-radiation induced DSB with a resolution below the diffraction limit. The resulting data of the correlation analysis of BRCA1 and Rad51 imply a subdivision of BRCA1 and Rad51 interaction in 3 phases during HR (early stage, processing stage, late stage). Intensity plots of the localization of BRCA1 and Rad51 show local exclusion within the foci and therefore support predictions of non-existing direct protein interaction.